円偏光二色性（CD）とタンパク質高次構造 ― α と β が混ざると、二次構造の推定は当て推量の1.4倍しか当たらない【2026年版】

バイオ医薬品の「高次構造を確認しました」という一文の後ろには、たいてい円偏光二色性（CD）のスペクトルがあります。 ICH Q6B が名指しし、日本薬局方にも一般試験法として収載されている、標準的な手法です。

その局方が、二次構造の解析について書いていることは、実質的に一文だけです。

円偏光二色性スペクトルから、二次構造の割合を解析する手法には、計算式を用いる手法、データベースより求める手法がある。 多変量解析により算出することもできる。いずれの手法を用いた場合も、算出に用いた方法を試験法に明記する。

どの参照データベースを使えとも、どれだけ合っていればよいとも書いていません。「使った方法を書け」だけです。

いっぽう、この分野で最も使われている解析サーバー DichroWeb の作者は、2022年の論文でこう書いています。 「CD にもとづく二次構造解析に使われるデコンボリューション法の精度を左右する最大の要因は、（データの波長範囲とならんで） 計算に用いた参照データセットである」。

つまり、局方が「明記せよ」としか言っていないその選択が、答えそのものを決めているわけです。

本記事は、JP19〈2.28〉の原文と、解析ツールの原著、そして「CD にはタンパク質二次構造解析にとって本質的な限界がある」と 題した2009年の論文の表を筆者自身が数え直したうえで、この手法が何を返し、何を返さないかを順に見ていきます。

この記事の読み方

• 入門者の方：1〜5節（局方が何を書いているか、CD が何を測っているか）と14節・分析者の視点で筋は通ります。
• 実務者の方：6〜13節が本体です。とくに10〜13節（参照データセット・β シートの誤判定・当て推量との比較・ 濃度誤差の伝播）は、報告書に数字を載せる前に確認しておく内容です。
• 筆者が計算した値には「筆者計算」と明記し、モデルと仮定も本文に書いています。
• 局方の条文は第十九改正日本薬局方 一般試験法の原文（厚生労働省が公開している PDF）から引いています。

1. 日本薬局方に、CD の一般試験法がある

まず事実確認から。〈2.28 円偏光二色性測定法〉は、第十八改正日本薬局方第一追補で新設されました。 厚生労働省告示第355号（令和4年12月12日、告示の日から適用）の冒頭に、 「一般試験法中、新たに追加した試験法は次のとおりである」として、 2.00 クロマトグラフィー総論 2.27 近赤外吸収スペクトル測定法 2.28 円偏光二色性測定法 の3件が並んでいます。

これが第十九改正日本薬局方（2026年4月10日適用）にそのまま引き継がれています。CD は、2022年末に日本の公定書に入った 比較的新しい一般試験法です。

冒頭の定義はこうです。

円偏光二色性測定法は、光学活性な化合物の光の吸収波長領域において、左右円偏光の吸収度合いが異なる現象 （円偏光二色性）を利用して、光学活性物質の構造解析、構造確認、鏡像異性体やジアステレオマーとの識別などに 用いられる方法である。

タンパク質専用の章ではありません。低分子の絶対配置確認から、ペプチド・タンパク質の二次構造まで、まとめて1つの章です。

なお、JP19 の一般試験法（全473ページ）を「高次構造」で全文検索すると 0 件です（筆者確認）。 ICH Q6B が使う "higher-order structure" にあたる言葉を、日局の一般試験法は使っていません。 〈2.28〉が書いているのは「二次構造の解析」と「三次元構造について推定することもできる」までです。

2. 何を測っているのか ― ΔA から、モル楕円率まで

局方の定義をそのまま追います。実測されるのは、左右円偏光の吸光度の差です。

ΔA ＝ A_L − A_R

これをモル吸光係数の差（モル円二色性）に直すと、

Δε ＝ ε_L − ε_R ＝ ΔA ÷ (c × l)　［(mol/L)⁻¹・cm⁻¹］

装置によっては楕円率（度）で表示されます。その場合のモル楕円率は、

[θ] ＝ θ ÷ (10 × c × l)　［°・cm²/dmol、θ は m°、c は mol/L、l は cm］

そして二つの単位は次で結ばれます。

[θ] ＝ 2.303 × Δε × 4500 ÷ π ≒ 3300 × Δε

この換算係数は自分で確かめられます。2.303 × 4500 ÷ π ＝ 3298.8（筆者計算）。局方の「≒3300」と合います。

さらに、異方性因子 g ＝ Δε ÷ ε も局方に定義があります。CD 信号を吸収そのもので割った量なので、 濃度と光路長が約分されて消えます。濃度が正確に分からない試料でも意味を持つ量です。13節でこの点に戻ります。

3. 平均残基分子量 115 ― 局方が置いた代表値

タンパク質の CD では、モル濃度の計算に分子量そのものではなく平均残基分子量を使います。

平均残基分子量 ＝ 分子量 ÷（アミノ酸残基数 又は ヌクレオチド残基数）

局方はその代表値をこう書いています。

平均残基分子量は、ペプチドやタンパク質の場合は 100 ～ 120（一般的には115）、核酸の場合はナトリウム塩として約330である。

ここに最初の「決めごと」があります。115 は代表値であって、あなたのタンパク質の値ではありません。 アミノ酸組成によって 100 にも 120 にもなります。115 を使うか実測組成から計算するかで、 報告するモル楕円率は最大で約 ±13 % 動きます（100〜120 の幅、筆者計算）。

4. スペクトルの帯 ― 局方が書いている極大位置

局方は二次構造ごとの特徴的な位置を明示しています。

構造	負の極大	正の極大
α ヘリックス	208 nm、222 nm	191 ～ 193 nm
β シート	216 ～ 218 nm	195 ～ 200 nm
不規則構造	195 ～ 200 nm	―

ここで注意すべきは、β シートの負の極大（216〜218 nm）と不規則構造の負の極大（195〜200 nm）が、 α ヘリックスの正の極大（191〜193 nm）と近いということです。混ざった構造では、これらが相殺します。 12節でその帰結を数字で見ます。

5. 局方が自分で書いている限界 ―「分子全体の平均的な性質」

〈2.28〉の 2.2「二次構造の解析」には、次の一文が入っています。

ただし、円偏光二色性測定では分子全体の平均的な性質を観察していることに留意が必要である。

短い文ですが、この手法の性格を言い切っています。CD は「どの残基が」を返しません。分子全体をひとつの平均として返します。 だから局所的な構造変化は、全体で薄まると見えなくなります。

NIST を中心とした共同研究（Yandrofski ら, Front. Mol. Biosci. 9:876780, 2022）も、同じことを別の言い方で書いています。

現在、治療用タンパク質の高次構造評価に主として使われている分光学的手法（FT-IR、DSC、ラマン、CD）は、 高次構造の高分解能なフィンガープリントも、高次構造の乱れの部位特異的な帰属も与えることができない。

6. 装置性能の確認 ― 局方が指定する二つの物質

〈2.28〉の3節は、装置性能の確認を二つに分けています。数値が明記されているのは、この節だけです。

3.1 円偏光二色性の正確さ：イソアンドロステロン 10.0 mg をエタノール（99.5）に溶かして正確に 10 mL。 層長 10 mm のセルで 280 nm から 360 nm を測定するとき、304 nm における Δε は +3.3。

3.2 変調の直線性：d-カンファスルホン酸アンモニウム 6.0 mg を水に溶かして正確に 10 mL。 層長 1 mm のセルで 185 nm から 340 nm を測定するとき、290.5 nm における Δε は +2.2 ～ +2.5、 192.5 nm における Δε は −4.3 ～ −5。

二つ目が重要です。290.5 nm と 192.5 nm という、離れた二波長を同時に見ています。 近紫外の一点だけでは、短波長側の光学系が健全かどうかは分かりません。二点で挟むから「変調の直線性」なのです。

この二点方式は現場でも使われていて、たとえば海洋生物由来タンパク質の CD 解析を報告した論文には 「装置は (+)-10-カンファースルホン酸で校正し、290.5 nm の正のバンドと 192.5 nm の負のバンドのあいだに 2:1 の比が 得られた」と書かれています（Loret ら, Mar. Drugs 16:134, 2018）。

7. その「比 2.0」は、局方の許容幅ではどこまで開くか

実務でよく言われる「比は約 2.0」を、局方の許容幅から自分で計算してみます（筆者計算）。

〈2.28〉が許すのは 290.5 nm で +2.2〜+2.5、192.5 nm で −4.3〜−5 です。比の絶対値がとりうる範囲は、

• 最小：4.3 ÷ 2.5 ＝ 1.72
• 最大：5.0 ÷ 2.2 ＝ 2.27

290.5 nm の Δε	192.5 nm の Δε	比
+2.5	−4.3	1.72
+2.2	−4.4	2.00
+2.5	−5.0	2.00
+2.2	−5.0	2.27

つまり、局方の判定にどちらも合格していても、比は 1.7 から 2.3 まで開きます。 「比が 2.0 だから大丈夫」という慣行は、局方より厳しい自主基準です。逆に言えば、 局方に適合しているだけでは、二つの装置のあいだで最大 3 割の食い違いが残りうるということでもあります。

同じ構図は UV-Vis分光光度計の実務と日本薬局方〈2.24〉 や 分光装置の適格性評価と波長校正 でも見ました。 校正されているのは装置の目盛であって、あなたの試料の答えではありません。

8. 二次構造の推定は、割り算ではない

ここから解析の話です。CD スペクトルから二次構造の割合を出す操作は、デコンボリューションと呼ばれます。

考え方は単純です。構造が既知のタンパク質の CD スペクトルを何十本も集めておき、 測定したスペクトルを「それらの重ね合わせ」として最もよく説明する係数の組を探す。その係数が二次構造の割合になります。

ここに、この手法の性格がすべて出ています。答えは、あらかじめ用意した参照スペクトルの組み合わせとしてしか出てきません。 参照に無い構造を持つタンパク質でも、必ずどれかの組み合わせとして返ってきます。「該当なし」は返りません。

DichroWeb はこの点に目印を用意しています。NRMSD（正規化二乗平均平方根偏差）です。 測定スペクトルと、得られた二次構造から逆算したスペクトルとのずれで、結晶構造解析の R 因子に相当します。 原著はこう書いています。

高い NRMSD 値（>0.1）、あるいは実験スペクトルと計算最適スペクトルの対応が悪いことは、 対象タンパク質が、参照データベースのどのタンパク質にも存在しない特徴を含んでいることの強い兆候である。

目安は手法によって違い、SELCON3 と CONTINLL は ≤0.1、CDSSTR は ≤0.01 とされています。

9. 参照データセットは何種類もあり、中身が違う

DichroWeb が選べる参照データセットの一覧です（Miles・Ramalli・Wallace, Protein Sci. 31, 37-46, 2022 の表から）。

データセット	収載タンパク質	波長範囲	収載数
SET3	水溶性球状	185–240 nm	37
SET4	水溶性球状	190–240 nm	43
SET5	水溶性球状	178–260 nm	17
SET6	水溶性球状＋変性	185–240 nm	42
SET7	水溶性球状＋変性	190–240 nm	48
SP175	水溶性球状	175–240 nm	71
SP175t	水溶性球状	190–240 nm	71
SMP180	膜タンパク質＋水溶性	180–240 nm	128
SMP180t	膜タンパク質＋水溶性	190–240 nm	128
Cryst175	クリスタリン型フォールド	175–240 nm	9

収載数は 9 から 128 まで、14 倍の開きがあります。波長範囲も 175 nm から始まるものと 190 nm からのものが混在します。 そして原著は「K2D を除くすべての手法は、少なくとも 190〜240 nm をカバーする実験データを必要とする」と明記しています。

10. 精度を決める最大の要因は、あなたが選んだ参照データセットである

前節の表を前にして、原著の一文が効いてきます。

CD にもとづく二次構造解析に使われるデコンボリューション法の精度を左右する、おそらく最も重要な要因は （データの波長範囲とならんで）計算に用いた参照データセットである。参照データセットを構成するタンパク質が、 問い合わせスペクトルのタンパク質と似た構造を持っているほど、計算の精度は高くなる。

そのとおりなら、答えを出す前に「自分のタンパク質に似たものが参照に入っているか」を知っていなければならないわけですが、 それが分かっているなら CD で二次構造を測る動機の半分は消えています。この循環が、この手法の使いにくさの正体です。

局方に戻ります。〈2.28〉が求めているのは「算出に用いた方法を試験法に明記する」だけでした。 どの参照データセットを選んだかを書くことは求められている。どれを選ぶべきかは書かれていない。 判定線を引くのは分析者、という構図がここでも繰り返されています。

11. β シートは信号が弱く、そして間違えられる

β シートには二重の不利があります。

第一に、信号が小さい。Wallace らはこう書いています。

β シートのスペクトルは、ヘリックス要素から生じるものの 3 分の 1 から 5 分の 1 の大きさのピークを持つ傾向がある。 その結果、β シートの特徴は分光学的に同定しにくくなり、とくに α/β 混合タンパク質では、 β シートによる信号が、より強いヘリックスの信号に埋もれてしまいうる。

第二に、β シートの CD スペクトルは一定ではない。BeStSel の原著はこう説明します。

既存の手法はヘリックス含量はおおむね正確に予測するが、β シート含量の予測にはしばしば失敗する。 β シートは平行／反平行の向き、鎖の長さと本数、そしてねじれが大きく異なりうる。（中略） 最悪の例は、β シート含量の高いアミロイド線維が、それまで利用可能だったほとんどの手法で ヘリックスと予測されたことである。

β シートの塊が、ヘリックスと報告される。符号が逆転するレベルの誤りが、既知の事実として文献に書かれています。

BeStSel はこの問題に対して、β シートを平行／反平行とねじれで分けることで対処しました。 2025年の更新版では、175–250 nm で α ヘリックス（Helix1）の RMSD が 0.023、反平行 β（Anti1）が 0.013 と報告されています。 ただし同じ表で、波長範囲を 200–250 nm に狭めると Anti1 の相関係数は 0.48 まで落ちます（2022年版では 0.62）。 短波長を捨てると、β シートの情報が真っ先に失われるということです。

12. 当て推量と比べる ― これが本記事の芯

ここまでは「精度が落ちる」という話でした。では、どれくらい落ちると使えないのか。 その線を引いた論文があります。Khrapunov の「円二色性分光法はタンパク質二次構造解析にとって本質的な限界を持つ」 （Anal. Biochem. 389, 174-176, 2009）です。

やり方は身も蓋もありません。スペクトルを一切見ずに、「どの構造も同じくらいある」と答えたらどうなるかを計算します。 具体的には、規則 α ヘリックス・歪んだ α ヘリックス・規則 β 鎖・歪んだ β 鎖を各 0.125、ターンと不規則構造を各 0.25 と 決め打ちします。この当て推量と結晶構造とのずれ（RMSDs）を、CD 由来の推定と結晶構造とのずれ（RMSDcd）と比べる。

原典の表を筆者が数え直したところ、表に載っているのは 30 タンパク質でした（筆者集計。内訳は all-α 5、α/β 混合 21、all-β 4）。結果はこうです。

クラス	タンパク質数	CD の RMSD 平均	当て推量の RMSD 平均	当て推量 ÷ CD
all-α	5	0.045	0.129	2.86 倍
α/β 混合	21	0.047	0.064	1.36 倍
all-β	4	0.075	0.121	1.63 倍

α だけのタンパク質なら、CD は当て推量より 2.9 倍良い。α と β が混ざると、1.4 倍しか良くない。

さらに、当て推量のほうが CD と同等かそれ以上に当たっていたタンパク質が 30 個中 5 個ありました（筆者集計）。

タンパク質	クラス	CD	当て推量
アルブミン	α	0.036	0.036
オボアルブミン	α/β	0.065	0.064
コンアルブミン	α/β	0.038	0.035
チオレドキシン	α/β	0.065	0.054
サブチリシン A	α/β	0.047	0.035

原典の結論はこうです。

我々は、α と β の要素が混在する構造を持つタンパク質については、CD スペクトルからの二次構造含量の 信頼できる意味のある推定はできないと結論する。（中略）同時に、そうした推定は、 フォールディングやアンフォールディングのような条件変化にともなう構造変化の相対的な尺度としては使える。

絶対値としては使えない。相対変化としては使える。この二文が、本記事全体の要約です。

原典は、その理由も5つ挙げています。(a) 参照結晶構造のラマチャンドランプロットの質が悪いものがある （最も好ましい領域が 90 % どころか 80 % を下回る構造がある）、(b) 参照スペクトルの多くが市販品を精製せずに測っている、 (c) 同じタンパク質のスペクトルがデータベース間で食い違う、(d) 参照と実験の装置間の相互検証がほとんど行われていない、 そして最後に、(e) 結晶構造から二次構造を割り当てるプログラム（DSSP・PROCHECK・STRIDE・XtlSSTR・PROMOTIF） どうしの食い違いが、表の RMSD と同程度の大きさである。

(e) は簡単には直せません。正解の側が一意に決まっていないからです。

13. 大きさが答えを動かす ― 濃度 10 % の誤差は、手法そのものの誤差と同じ大きさ

2節の式に戻ります。[θ] ＝ θ ÷ (10 × c × l)。モル楕円率は濃度と光路長に反比例します。 そしてデコンボリューションはスペクトルの大きさを合わせにいくので、大きさの誤差はそのまま割合の誤差になります。

線形なデコンボリューションでは推定割合がスペクトルの大きさに比例する、という仮定だけを置いて計算しました （筆者計算）。ヘリックス 40 % と報告した場合です。

誤差	倍率	見かけの割合	割合のずれ
濃度を 5 % 過大に見積もる	0.952	0.381	0.019
濃度を 10 % 過大に見積もる	0.909	0.364	0.036
濃度を 10 % 過小に見積もる	1.111	0.444	0.044
光路長 0.010 cm のつもりが実際 0.0095 cm	1.053	0.421	0.021
濃度 +10 % と光路長 +5 % が重なる	0.866	0.346	0.054

濃度を 10 % 間違えるだけで、割合は 0.036 動きます。12節の表を見返してください。 CD 由来の推定そのものの RMSD が 0.045〜0.047 でした。つまり、 濃度の 10 % の誤差は、手法そのものの誤差とほぼ同じ大きさです。

これは机上の話ではありません。Wallace らの実務ガイドは、両方について具体的に警告しています。

• 濃度：「二次構造解析は、タンパク質濃度測定の正確さに大きく影響される」。Biuret・Lowry・BCA・ クマシー染色といった比色法は「アミノ酸組成に応じて、どれも異なる値／正確さを与える」。280 nm の吸光度が 最も便利で信頼できる。
• 光路長：光路長 0.01 cm 未満の分解型セルでは「メーカー公称値には大きな誤差の余地がありうる」うえ 「セルの装着と組み立ては再現しないことがある」。干渉縞法で実測すべき。

局方も同じ場所を指しています。〈2.28〉の測定法にはこうあります。「試料セルの光路長、特に光路長が短い際には 注意が必要である。」

もうひとつ、2節で触れた異方性因子 g ＝ Δε / ε を思い出してください。これは濃度と光路長が約分されて消える量です。 濃度が正確に決まらない試料では、この量のほうが素直です。

14. では何に使えるのか ― ICH Q6B が求めていること

ICH Q6B（バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品の規格及び試験方法の設定）の付録には、 CD への言及が1か所あります。原文はこうです。

f) Spectroscopic profiles 紫外・可視吸収スペクトルを適宜測定する。製品の高次構造は、円二色性、核磁気共鳴（NMR）、 その他の適切な手法などの手順を用いて、適宜検討する。

「検討する（examined）」だけです。どの程度一致すればよいかも、どの手法が優先かも書かれていません。 CD はもう1か所、脱アミド化・異性化・酸化などの修飾体を検出しうる手法の例としても挙げられています。

規制と局方の両方が「使え」とは言い、「どう判定するか」は言わない。前節までを踏まえると、これは無責任ではなく 正確な態度だと分かります。12節のとおり、絶対値としての精度が保証できないのですから、 一律の判定値を置けるはずがありません。

残るのは相対比較です。同じ装置・同じ濃度測定法・同じセル・同じ参照データセットで、 参照品と被検品のスペクトルを重ねる。差が出るかどうかを見る。これは CD が得意とすることで、 Khrapunov の結論の後半（「構造変化の相対的な尺度としては使える」）そのものです。

分析者の視点

三つ挙げます。

第一に、二次構造の「割合」を単独の数値として報告しない。報告するなら、アルゴリズム名・参照データセット名・ 波長範囲・NRMSD を必ず併記する。局方が「算出に用いた方法を試験法に明記する」と書いているのは最低限で、 実務的にはこの4つが揃って初めて他人が再現できます。9節の表のとおり、参照データセットは収載数が 9 から 128 まで違います。

第二に、比較のときは大きさに依存しない量を先に見る。13節のとおり、濃度 10 % の誤差だけで手法の誤差と同じだけ 割合が動きます。参照品と被検品を比べるなら、スペクトルの形（極大位置と符号）と異方性因子 gを先に見て、 そのうえで割合を出す。局方が異方性因子をわざわざ定義しているのは、この使い方があるからです。

第三に、β シートが主体の試料では、答えの符号を疑う。11節のとおり、アミロイド線維がヘリックスと予測された 実例が文献にあります。β リッチな系（抗体、膜タンパク質、凝集体）では、 β シートを分けて扱う手法（BeStSel など）を使い、可能なら 190 nm より短波長のデータを取る。 200–250 nm に切り詰めると、反平行 β の相関係数は 0.48 まで落ちます。

まとめ

• 〈2.28 円偏光二色性測定法〉は JP18 第一追補（厚生労働省告示第355号、令和4年12月12日）で新設され、JP19 に収載。 日局の一般試験法に「高次構造」という語は0 件（筆者確認）。
• 局方の換算式：ΔA ＝ A_L − A_R、Δε ＝ ΔA/(c·l)、[θ] ＝ θ/(10·c·l)、[θ] ≒ 3300·Δε （2.303×4500÷π ＝ 3298.8、筆者計算）。平均残基分子量はペプチド・タンパク質 100〜120、一般に115。
• 局方が数値を書いているのは装置性能の確認だけ。イソアンドロステロン 304 nm で Δε ＝ +3.3、 d-カンファスルホン酸アンモニウム 290.5 nm で +2.2〜+2.5 / 192.5 nm で −4.3〜−5。
• その許容幅では二点の比は 1.72〜2.27 まで開く（筆者計算）。「比 2.0」は局方より厳しい自主基準。
• 二次構造の解析について局方が書いているのは「算出に用いた方法を試験法に明記する」の一文だけ。
• 精度を左右する最大の要因は参照データセット（DichroWeb 原著）。選べるデータセットは収載数 9〜128。
• β シートの信号はヘリックスの 1/3〜1/5。アミロイド線維がヘリックスと予測されていた（BeStSel 原著）。 200–250 nm に切り詰めると反平行 β の相関は 0.48 に低下（BeStSel 2025年版）。
• α/β 混合タンパク質では、CD は「全部同じくらい」という当て推量の 1.36 倍しか当たらない （筆者集計、Khrapunov 2009 の表30個）。当て推量が同等以上だった例が 30 個中 5 個。
• 濃度を 10 % 間違えると割合は 0.036 動く（筆者計算）。手法そのものの RMSD 0.045〜0.047 と同程度。
• 絶対値としては使えない。相対変化としては使える。ICH Q6B も「examined（検討する）」としか書いていない。

用語集

• 円偏光二色性（CD）：左円偏光と右円偏光の吸収の差。日本薬局方の章名は「円偏光二色性測定法」。
• モル円二色性 Δε：左右円偏光のモル吸光係数の差。単位は (mol/L)⁻¹・cm⁻¹。
• モル楕円率 [θ]：楕円率で表した CD。単位は °・cm²/dmol。[θ] ≒ 3300·Δε。
• 平均残基分子量：分子量を残基数で割った値。タンパク質では一般に 115 を使う。
• 異方性因子 g：Δε ÷ ε。濃度と光路長が約分されるので、濃度が不確かな試料で有効。
• デコンボリューション：既知構造タンパク質の参照スペクトルの重ね合わせとして測定スペクトルを説明し、 その係数から二次構造の割合を求める操作。
• 参照データセット：デコンボリューションに使う既知構造タンパク質のスペクトル集合。SP175、SMP180 など。
• NRMSD：測定スペクトルと、推定結果から逆算したスペクトルとのずれ。結晶構造解析の R 因子に相当。
• HT（ダイノード）電圧：検出器に加える電圧。試料の吸収が大きいほど上がる。上限を超えるとスペクトルが歪む。
• SRCD：シンクロトロン放射円二色性。高輝度光源で 190 nm より短い波長のデータを取る。
• 高次構造（HOS）：二次・三次・四次構造の総称。ICH Q6B の用語。日局の一般試験法には出てこない。

出典

1. 第十九改正日本薬局方 一般試験法〈2.28 円偏光二色性測定法〉（2026年4月10日適用）。全文 PDF：https://www.mhlw.go.jp/content/11120000/001689414.pdf （該当は p.123-125、0起点）
2. 第十八改正日本薬局方第一追補（厚生労働省告示第355号、令和4年12月12日、告示の日から適用）。 「一般試験法中、新たに追加した試験法」として〈2.28〉を明記。https://www.jfrl.or.jp/storage/file/221212_JP18S1.pdf
3. Miles AJ, Ramalli SG, Wallace BA. "DichroWeb, a website for calculating protein secondary structure from circular dichroism spectroscopic data." Protein Sci. 31(1), 37-46 (2022). doi:10.1002/pro.4153 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8740839/
4. Miles AJ, Janes RW, Wallace BA. "Tools and methods for circular dichroism spectroscopy of proteins: a tutorial review." Chem. Soc. Rev. 50, 8400-8413 (2021). doi:10.1039/d0cs00558d https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8328188/
5. Micsonai A, Wien F, Bulyáki É, et al. "BeStSel: a web server for accurate protein secondary structure prediction and fold recognition from the circular dichroism spectra." Nucleic Acids Res. 46, W315-W322 (2018). doi:10.1093/nar/gky497 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6031044/
6. Micsonai A, Wien F, Murvai N, et al. "BeStSel: analysis site for protein CD spectra—2025 update." Nucleic Acids Res. 53 (2025). doi:10.1093/nar/gkaf378 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12230724/
7. Khrapunov S. "Circular dichroism spectroscopy has intrinsic limitations for protein secondary structure analysis." Anal. Biochem. 389(2), 174-176 (2009). doi:10.1016/j.ab.2009.03.036 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC2696129/
8. ICH Q6B "Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products"（Step 4, 1999）。https://database.ich.org/sites/default/files/Q6B%20Guideline.pdf
9. Yandrofski K, Mouchahoir T, De Leoz ML, et al. "Interlaboratory Studies Using the NISTmAb to Advance Biopharmaceutical Structural Analytics." Front. Mol. Biosci. 9, 876780 (2022). doi:10.3389/fmolb.2022.876780 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9117750/
10. Loret EP, Luis J, Nuccio C, et al. "A Low Molecular Weight Protein from the Sea Anemone Anemonia viridis with an Anti-Angiogenic Activity." Mar. Drugs 16(4), 134 (2018). doi:10.3390/md16040134 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5923421/ （CSA 校正の 2:1 比の実例）
11. Miles AJ, Wallace BA. "CDtoolX, a downloadable software package for processing and analyses of circular dichroism spectroscopic data." Protein Sci. 27, 1717-1722 (2018). doi:10.1002/pro.3474 https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6194270/

関連記事

• UV-Vis分光光度計の実務と日本薬局方〈2.24〉 ― その吸光度は、装置が測った数字ではない ― 同じ紫外域で、局方が何を決めて何を決めていないか。
• 分光装置の適格性評価と波長校正 ― 波長が合っていることは、その数値が正しいことを意味しない ― 校正の枠組み側。本記事6〜7節と対で読める。
• 蛍光分光の実務 ― その蛍光強度は、その装置でしか意味を持たない ― 装置依存の信号をどう扱うか。CD の HT 電圧と同じ問題。
• SEC/GPC（サイズ排除）徹底解説 ― その分子量は、標準物質と条件に依存すると局方が書いている ― 参照物質が答えを決める、という同型の問題。凝集体の評価では CD と併用する。
• プロテオミクスのDDA/DIA ― タンパク質の「FDR 1%」が妥当だと確かめられた組み合わせは、24件中ゼロだった ― 参照ライブラリが答えの範囲を決める、という同じ構造を質量分析側から。
• 分光分析の全体像 ― FTIR・ラマン・UV-Vis・NIR は「違う深さ」を見ている ― 分光クラスタのハブ。

未確認・限界

• 12節の集計は筆者が原典の表を数えたものです。筆者が数えた行数は 30（all-α 5 / α/β 21 / all-β 4）でしたが、 原典の本文は「31 タンパク質」「αβ クラスの 22 タンパク質」と書いており、それぞれ 1 個ずつ食い違います。 PMC 版の表の描画で 1 行が落ちている可能性があり、この 1 行の差は本記事の平均値をわずかに動かしえます。 クラス平均の比（2.86 / 1.36 / 1.63 倍）は筆者が計算した値です。
• 13節の誤差伝播も筆者計算です。「推定される二次構造の割合がスペクトルの大きさに比例する」という仮定を置いています。 実際のアルゴリズムは制約付き最小二乗や変数選択を含むので、比例からずれます。向き（大きさの誤差が割合を動かす）は 原典が明記していますが、値そのものは筆者のモデルによります。
• 7節の比の範囲も筆者計算です。局方は比そのものについて何も規定していません。両端の値を組み合わせただけです。
• 3節の「±13 %」は 100〜120 の幅から出した値で、実際の平均残基分子量はタンパク質ごとにアミノ酸組成から計算できます。
• ICH Q6B の引用は英語原文を筆者が訳したものです。日本語訳通知（医薬審第571号など）の訳文とは表現が異なる場合があります。
• BeStSel 2025年版の RMSD・相関係数は原著の表から引いた値で、参照データベース上での性能です。 未知試料での性能を保証するものではありません。
• 市販装置の型番・仕様は本記事では扱っていません。メーカーの製品ページが取得できず、 一次情報で裏が取れなかったため落としました（ディープリサーチの出力には仕様値が含まれていましたが、 出典を自分で開いて確認できないため採用していません）。
• SRCD（シンクロトロン放射 CD）は原理と利点に触れるにとどめ、ビームライン固有の性能値は扱っていません。

---

制作メモ：ディープリサーチで文献の当たりを付けたうえで、局方の条文・数値はすべて厚生労働省公開の 第十九改正日本薬局方 一般試験法 PDF と第十八改正第一追補の告示 PDF を直接開いて確認し、 論文の数値・逐語は PMC / Europe PMC の原著から取りました。計算値には「筆者計算」「筆者集計」と明記しています。